臭氧疗法在治疗COVID-19中的应用

作者介绍

作者：西尔维娅·梅内德斯-塞佩罗¹，何塞·安东尼奥·马奎斯²，阿尔贝托·赫尔南德斯-马丁内斯³，弗兰西斯科·哈维尔·伊达尔戈·塔里翁⁴，何塞·巴埃萨-诺西⁵

1 – 科学顾问，美国佛罗里达

2 – 西班牙比戈市克拉罗诊所

3 – 西班牙伊比萨岛罗萨里奥圣母医院麻醉及复苏部

4 – 西班牙圣安东尼奥·穆尔西亚天主教大学臭氧治疗与慢性疼痛主席

5 – 西班牙瓦伦西亚大学医学与外科学院

通讯作者：西尔维娅·梅内德斯-塞佩罗，电话：+17866263684，邮箱：silvia30102005@yahoo.es。

2020年8月12日发表于《神经学及神经重症监护杂志》。

摘要及关键词

自2019年12月以来，导致新冠肺炎的SARS-Cov2病毒在全球范围内传播、流行，目前尚无特定的治疗方法。每个患者的感染情况有所不同，个别病例在感染10天后有致命的现象。已知该病毒会引起急性呼吸窘迫综合症（ARDS）。细胞因子风暴被认为是ARDS和多器官衰竭的主要原因之一。由于SARS-CoV2感染的高致死性及其经济和社会影响，因此有必要寻求新的治疗方法。现已证明，臭氧疗法可显着改善缺血组织的血流量和氧合作用。同样，臭氧可以在Nrf2和NF-κB因子之间达到平衡，从而调节氧化应激和促炎性细胞因子的表达。在临床研究中，臭氧在治疗肺血管疾病中具有重要作用。今天，臭氧疗法代表了整合标准疗法以实现体内平衡的最实用方法。因此，鉴于于臭氧的治疗作用，可以提出作为SARS-CoV-2的辅助疗法。三个随机对照试验（NCT04359303，NCT04370223和NCT04444531）正在等待西班牙的分类，批准和启动。还有一个在伊朗（IRCT20190618043923N4），意大利两个（NCT04366089和NCT04388514）试验已经在一个月前启动。

【关键词】2019冠状病毒病，免疫调节，NF-Kb, Nrf2, 氧化应激，臭氧治疗

背景介绍

根据世界卫生组织（世卫组织）的说法，病毒性疾病不断出现，对公共卫生构成了严重的问题。2019年12月31日，世界卫生组织驻中国代表处首次接到了原因不明的下呼吸道感染的流行病报告。这种新病毒称为SARS-CoV-2，病因是“ COVID-19” ，即“ 2019年冠状病毒病”首字母缩写。这些患者中许多都迅速恶化，需要插管和靠设备呼吸，死亡率约为3.7％，目前尚无有效的治疗方法。预防是最好的选择，治疗策略是先处理感染病例，旨在减缓病毒在社区内的传播速度。

新冠肺炎已知具有两种综合征的特征：

巨噬细胞活化综合征：一种威胁生命的并发症，特征是高细胞因子血症（细胞因子风暴）并伴有多器官衰竭。它的特征是T淋巴细胞和巨噬细胞不受控制地激活和增殖，作为内皮损伤引起广泛的组织损伤，导致微血栓的产生。实验室发现白细胞，血小板和血红蛋白减少异常，证据就是高水平的转氨酶，铁蛋白的显着增加和血管内凝血激活。这场风暴的主角主要是白细胞介素6（IL-6），它可以促进B淋巴细胞的分化。细胞因子风暴还刺激急性期蛋白的产生，并进一步在温度调节，骨骼维持和中枢神经系统功能中发挥作用。在发炎性疾病，感染，自身免疫性疾病，心血管疾病和某些类型的癌症等病例中，白细胞介素（IL-6）都有升高的现象。

抗磷脂综合征：这是一种自身免疫系统疾病，临床表现为反复性静脉或动脉血栓形成。这也改变了血液的稳态调节。大多数肺炎患者的D-二聚体升高，其他凝血指标异常。还观察到血小板减少症，这似乎与预后较差有关。从分析上看，血液中铁蛋白水平很高。它们似乎对急性炎症过程有反应。肝酶也倾向于升高。在过氧化氢的存在下，释放到血液中的铁离子会产生羟基自由基（芬顿反应）。这是剧毒的，会引起氧化损伤，主要是肺部的，也是全身性的。肺组织损伤会刺激单核细胞-巨噬细胞系统，从而极大地促进炎症过程。考虑到臭氧治疗所有的特性（将在下面进行解释），建议其可以作为新冠患者的辅助治疗。

臭氧疗法及其作用原理

臭氧（O₃）是氧元素的同素异形体，比氧气多一个原子。它特别不稳定，会自发分解为2个氧原子，这使其很难运输和存储。自上世纪初以来，臭氧疗法已用于治疗，如今人们对臭氧疗法的需求日益增长。它的特点是应用简单，效率高且具有良好的耐受性。国际上对使用臭氧疗法产生不良反应的报道将其列为最低发生率，为0.0007％。具有治疗剂量的臭氧能够产生小的，短暂的和可控制的氧化应激反应，该氧化应激反应可激发一组受压抑的生物学功能而不会引起任何不良反应。臭氧的这种预处理作用能够重新平衡生物体中令人不安的氧化还原状态。从生化角度看，当血液暴露于臭氧中几分钟后，它会立即与生物流体中存在的不同分子发生反应，即抗氧化剂，蛋白质，碳水化合物，以及优先选择的多不饱和脂肪酸（克里吉反应），导致形成α-羟基-氢过氧化物，过氧化氢，臭氧化物和醛类（例如4-羟基壬烯醛）。这些重要的信号分子，在调节炎症，细胞增殖，细胞生长和细胞死亡中起关键作用。

这些烯醛可以激活存在于与Keap-1蛋白结合的细胞质中的核转录因子，称为核因子红系2相关因子2（Nrf2）。这样的蛋白质具有-NH2且主要具有-SH基团（Cys273和Cys288），其通过以皮摩尔水平结合烯键[例如4-羟基壬烯醛（4-HNE）]，引起有利于Nrf2解离的构象变化。然后将其导入细胞核，在与Maf（肌腱膜纤维肉瘤）蛋白质形成异源二聚体后，与DNA上的抗氧化反应元件（ARE）相互作用。因此，各种器官中几种抗氧化酶（超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，谷胱甘肽还原酶，谷胱甘肽S转移酶，NADPH-醌氧化还原酶，热休克蛋白70，II期酶和血红素加氧酶-1）的合成被上调。同样，减少铁超载，以及随后因铁蛋白升高引起的氧化应激反应。抗氧化剂能力的提高是抵抗慢性氧化应激加剧的典型慢性炎症的关键步骤。哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的肺气肿患者，通过臭氧疗法治疗后，抗氧化反应得到了改善。具体而言，在IgE水平，炎症反应，呼吸测试和临床状况方面均见改善。同样，在类风湿关节炎患者中，臭氧也发挥了有益作用。

这种臭氧功效不仅可以通过其对细胞因子控制的作用（IL-1，IL-6和肿瘤坏死因子α-TNFα降低）来体现，也可以重新建立细胞氧化还原平衡。已知活性氧可以充当第二信使，以激活核转录因子NF-κB，后者可调节炎症反应相关基因的表达。Nrf2能够通过多种机制直接或通过与NF-κB的相互作用来调节炎症，例如氧化还原稳态的调节和促炎基因的抑制。炎症会增加局部和全身的活性氧（ROS）水平，而ROS会增强炎症。Nrf2介导的ROS稳态控制可以打破这种恶性循环。Nrf2通过阻止RNA聚合酶II募集来启动促炎性细胞因子IL-6和IL-1β的基因转录来减轻炎症。Nrf2维持氧化还原稳态的能力将防止DNA损伤，保护蛋白稳态并改善线粒体功能，同时抑制急性和慢性炎症。臭氧的抗氧化和抗炎作用涉及Nrf2的活化，因此，Nrf2被认为是臭氧处理功效的关键因素。先前的一项研究报道说，臭氧预处理可显著降低肝脏缺血/再灌注损伤中的NF-κB表达并抑制炎症反应。臭氧可以在Nrf2和NF-κB之间达到平衡，从而调节促炎性细胞因子的表达，对细胞保护具有重要作用（见下图）。 

臭氧能够产生小的，暂时的和受控的氧化应激反应。核转录因子Nrf2通常以与Keap-1蛋白复合的形式存在于细胞质中。4-HNE（臭氧活性代谢物）与Keap1的Cys151结合并抑制Nrf2的组成型抑制，然后该结构转位到核中。与Maf结合后，Nrf2与ARE结合并开始合成高度细胞保护性酶（SOD，过氧化氢酶，GSH，血红素加氧酶-1，HSP等），从而维持氧化还原平衡。NF-κB也是一种氧化还原调节的转录因子，参与炎症，免疫功能，细胞生长和细胞凋亡。在休息时，它以与抑制剂IκB复合的非活性形式存在。在存在氧化应激的情况下，H₂O₂（臭氧活性代谢物）会激活酪氨酸激酶，从而使IκB磷酸化并使其脱离非活性复合物。异二聚体迅速从胞质溶胶进入细胞核，在那里它调节基因表达，形成新蛋白，例如细胞因子（IL-1，IL-2，IL-6，IL-10，TNF-α），COX-2，iNOS，粘附分子（ICAM），组织因子，免疫调节分子。同时，这两个途径通过蛋白质-蛋白质相互作用或次级信使效应在转录水平上互相抑制。Nrf2反对促炎细胞因子基因的转录上调。Nrf2与包括IL-6和IL-1β在内的炎性细胞因子基因结合，并抑制其转录。Nrf2途径还通过阻止IκB-α的降解来抑制NF-κB介导的转录。同时，Nrf2上调编码抗氧化蛋白的基因的表达。类似地，除其他因素外，NF-κB介导的转录通过减少ARE基因转录来降低Nrf2激活。因此，可以认为臭氧参与了这两个转录因子之间的平衡。

Nrf2，核因子类红细胞2相关因子2；Keap1，类Kelch类红细胞衍生蛋白；Maf，肌腱膜纤维肉瘤；ARE，抗氧化剂反应元件；HO-1，血红素加氧酶-1；4-HNE，4-羟基壬醛; HSP，热激蛋白；SOD，超氧化物歧化酶；GSH，还原型谷胱甘肽；H₂O₂，过氧化氢; TNF，肿瘤坏死因子；COX-2，环氧合酶-2；ICAM，细胞间粘附分子；iNOS，诱导型一氧化氮合酶。

此外，Nrf2激活剂可能通过激活内在的细胞保护蛋白并抑制促炎介质来减轻Toll样受体（TLR）介导的异常炎症。因此，这两个主要的信号传导途径可能相互作用不同，并且可以通过调节其串扰来调节炎症。TLR激活通过触发炎症细胞因子的产生，增强适应性免疫，在针对病原体的炎症反应的启动中至关重要。同时，还存在一种负反馈机制，可以防止TLR信号过度激活，否则可能导致慢性炎症或自身免疫。Nrf2激活会干扰促炎蛋白的表达并抑制炎症。TLR和Nrf2的相互作用有助于调节炎症过程。TLR信号传导与Nrf2-Keap1途径之间的联系可作为通过炎症调节免疫调节与氧化应激反应之间的桥梁。现已证明，臭氧预处理可通过阻断肾脏缺血/再灌注损伤中TLR4-NF-κB途径的活化来改善肾脏炎症和损害。此外，臭氧显著降低了TNF-α，IL-1β，IL-6，ICAM-1（细胞间粘附分子1）和MCP-1（单核细胞趋化蛋白1）的mRNA水平。另一方面，事实证明，医用臭氧在体外可有效抵抗病毒，细菌，真菌和孢子，破坏细胞膜和包裹病毒。 

 臭氧疗法及其在新冠肺炎患者治疗中的积极作用

有利于新冠肺炎患者正向发展的臭氧疗法的治疗效果包括：

臭氧改善氧代谢，增加细胞氧合能力。由于2,3-DPG的活化，改善了己糖-单磷酸酯的分流，它通过与血红蛋白（Hb）的β-链结合，导致Hb解离曲线的向右侧移动。这增强了缺氧组织中氧气的释放。红细胞糖酵解途径的改善也显着增加了其ATP含量，恢复了红细胞膜的弹性，从而改善了血液流变学和毛细血管现象。臭氧处理可显着改善缺血组织的血流量和氧合作用。这是由于一氧化氮（NO），S-亚硝基硫醇与一氧化碳（CO）结合并释放了前列环素。不同的临床前和临床研究证明了臭氧在调节NO水平中的作用及其在保护血管内皮细胞中的重要性。

臭氧能够诱导干扰素和相关细胞因子的释放和调节。此外，还可以刺激抗氧化剂防御系统，抵消新冠患者遭受的过度炎症，细胞因子风暴和氧化应激状态。这是通过增加Nrf2因子并恢复细胞氧化还原平衡来实现的。还可以通过增加CO和胆红素的释放来激活血红素加氧酶-1（HO-1），这有助于减少炎症。一些临床前和临床研究报告证实了促炎细胞因子如IL-1，IL-6，TNFα以及ICAM-1，MCP-1等的减少。臭氧能够调节外周血中的吞噬细胞，以及信使如何激活免疫应答从而导致治疗性生物学效应的机制。这将对新冠肺炎感染有非常积极的影响。炎症反应是严重SARS-CoV-2感染的标志，细胞因子风暴可导致这些患者死亡。臭氧疗法的保护作用是通过调节其含炎性小体的含吡啶结构域3（NLRP3）的核苷酸结合寡聚结构域样受体，增强Nrf2的抗氧化活性和抑制细胞凋亡来实现的，具有抗炎特性。NLRP3炎性小体是先天免疫系统的重要组成部分，可响应微生物感染和细胞损伤，介导caspase-1激活和促炎细胞因子IL-1β/ IL-18的分泌。另一方面，SARS-CoV-2激活Toll样受体（例如TLR4）会导致生化级联反应，首先是被caspase-1切割的pro-IL-1形成，然后是炎性体的激活。IL-1分泌在巨噬细胞外，介导肺部炎症，发烧和纤维化，并引发严重的呼吸系统疾病。已经证明，臭氧预处理可通过调节TLR4-NF-κB途径保护大鼠肾脏免于再灌注损伤。

新冠肺炎患者由于粘度增加和红细胞聚集等原因而患有微血栓。臭氧具有抗血小板作用，增加一些前列环素（如PGI2）导致血管舒张，并调节抗凝血酶III 。所有这些作用，加上更好的血液循环，可以帮助减少这些患者出现的高凝现象。

臭氧可以通过控制Nrf2来平衡细胞的氧化还原状态，从而阻止病毒的复制能力。SARS-CoV-2细胞的进入取决于血管紧张素转换酶2（ACE2）和跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）。SARS峰值蛋白S将附着在ACE2上。附着于ACE2后，病毒进入需要S蛋白引发，这是通过TMPRSS2切割S蛋白来完成的。TMPRSS2活性对于病毒在受感染宿主中的传播和发病机制至关重要，并且已经研究了TMPRSS2抑制剂作为SARS-CoV-2的潜在治疗靶标。Nrf2激活剂通过抑制TRMPSS2抑制病毒进入，从而在减少病毒发病机理中起着重要作用。Nrf2激活剂可能提供多种方式来重新控制重要途径，从而增加耐药性并减慢病毒复制。使用NRF2激活剂后，人肝源性HepG2细胞中ACE2 mRNA下调了3.5倍，而TMPRSS2下调了2.8倍。与Nrf2 + / +小鼠相比，Nrf2-/-小鼠肺损伤的加剧与炎症细胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6）的肺表达增加以及肺抗氧化剂和解毒酶的减少有关^[57]。此外，在Nrf2 + / +小鼠中用Nrf2-ARE诱导剂萝卜硫烷进行的预处理显着减弱了呼吸道合胞病毒（RSV）诱导的支气管肺部炎症，上皮损伤和肺病毒表达。该研究的结果证实了氧化应激与RSV发病机理有关，并为Nrf2-ARE作为抵抗RSV疾病的宿主防御机制的重要调控作用提供了令人信服的证据。另一项研究发现，Nrf2表达水平与鼻上皮细胞内甲型流感病毒的进入和复制之间存在反比关系。响应于实验性应用的机械通气，与Nrf2 + / +小鼠相比，在Nrf2-/-中发现了更高水平的肺泡和血管通透性以及炎症反应。在小鼠中，Nrf2缺乏症引起卵白蛋白驱动的气道炎症增强和反应过度。在这项研究中，相对于Nrf2 + / +小鼠，Nrf2-/-小鼠过敏反应的增强与更明显的肺粘液细胞增生，嗜酸性细胞浸润，Th2细胞因子IL-4和IL-13的增加以及多种抗氧化剂的抑制有关 。在实验性脓毒症模型中，Nrf2缺乏症增加了小鼠抵抗细菌内毒素（LPS）和盲肠结扎以及穿刺诱导的败血性休克的炎症和死亡率。这表明Nrf2是败血症的新型修饰物，可通过启动适当的先天免疫应答来确定存活率。因此，数据表明，Nrf2-ARE激活剂对LPS诱导的炎症具有保护作用，并表明其对介入性败血症综合征的潜在治疗作用。考虑到臭氧会刺激Nrf2，这可能是阻止内源性新冠病毒再复制的重要生理机制，可通过下调ACE2和TMPRSS2阻止SARS-CoV-19受体的接触，从而使病毒进入细胞的能力失活。用臭氧疗法实现的细胞氧化还原状态的重新平衡在诱导单核细胞和淋巴细胞中细胞因子合成以及释放HO-1和热激蛋白（它们是免疫系统的有效激活剂）方面也很重要。 

结论

总而言之，臭氧疗法的积极方面是激活多种防御机制的能力，这些防御机制可以重新恢复正常的氧化还原系统并调节NFκB/ Nrf2途径。今天，臭氧疗法代表了整合标准疗法以实现体内平衡的最实用方法。因此，鉴于臭氧的治疗作用，提出它可以作为SARS-CoV-2的辅助治疗。三个随机对照试验（NCT04359303，NCT04370223和NCT04444531）正在西班牙等待分类和启动批准，一个在伊朗（IRCT20190618043923N4），另外两个（NCT04366089和NCT04388514）在一个月前已在意大利开始启动。

臭氧疗法可以用于新冠肺炎的治疗。

臭氧可以在Nrf2和NF-κB之间达到平衡，调节氧化应激和促炎细胞因子。

臭氧可消解过度炎症，细胞因子风暴和氧化应激。

臭氧可改善氧代谢，血流和缺血组织的氧合作用。

其他

西尔维娅·梅内德斯-塞佩罗，构想稿件，起草，编辑和修订草稿。 

何塞·安东尼奥·马奎斯，阿尔贝托·赫尔南德斯-马丁内斯，弗兰西斯科·哈维尔·伊达尔戈·塔里翁，何塞·巴埃萨-诺西等对论文草稿进行构想和严格审查。 

所有作者均已批准手稿的最终版本。

所有作者声明他们没有利益冲突。

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